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內(nèi)切酶的酶切技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理值得關(guān)注!

發(fā)布時(shí)間: 2021-06-22  點(diǎn)擊次數(shù): 1600次
   內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離出來(lái)的一種能在特異位點(diǎn)切割DNA分子的核酸內(nèi)切酶,目前已從多種細(xì)菌中分離出超過(guò)400種,識(shí)別各自不同的核苷酸順序,這一順序大多為具有一對(duì)稱中心的回文序列,如從大腸桿菌中分離的EcoR I識(shí)別:…GAATTC…切割后產(chǎn)生
  …CTTAAG…
  …G和AATTC…的末端
  …CTTAA G…
  該末端由于有一段小的能互補(bǔ)配對(duì)的單鏈突出,故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團(tuán)。即…G-OH
  …CTTAA-P。
  有的限制性酶識(shí)別四堿基對(duì)的順序,如San3A識(shí)別GATC;有的識(shí)別六堿基對(duì),如上述的ECOR I。識(shí)別四堿基對(duì)的內(nèi)切酶由于識(shí)別順序在DNA出現(xiàn)的頻率更高(四堿基酶為44=256,六堿基酶為46=4096),因而可將DNA切割成更小的片段,而識(shí)別八堿基對(duì)的Not I
  …GCGGCCGC…
  …CGCCGGCG…。
  則識(shí)別和切割位點(diǎn)更少(48=65536),但堿基并不以均等的概率出現(xiàn),因而切割后產(chǎn)生的片段變化范圍很大。
  限制性內(nèi)切酶作用的溫度一般為37℃,反應(yīng)體系中以Mg2+為單獨(dú)的輔助因子,且要求pH緩沖在7.5左右。
  商品酶都保存在50%的甘油溶液中,-20℃貯存,活性通常較高,5u/μl(每單位即最適條件下1小時(shí)內(nèi)*酶解1μg DNA的酶量)。
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